◈ 702生物化學第1章 蛋白質的結構與功能在線免費閱讀

702生物化學第2章 核酸的結構與功能在線免費閱讀

1.構成蛋白質的 20 種基本氨基酸的結構特點、重要性質及氨基酸混合物的分離分析

氨基酸的主要理化性質:

①氨基酸的旋光性。除甘氨酸外,其餘氨基酸均至少含有一個手性碳原子,因此都具有旋光性。

②氨基酸的紫外吸收性質:Ty r酪氨酸。Tr p色氨酸,Phe丙苯氨酸的R基團含有苯環,在近紫外區220~300納米,具有明顯的光吸收能力,可用於蛋白質的定性定量分析。

③氨基酸的兩性性質:氨基酸是兩性電解質,它在溶液中的帶電狀況隨溶液pH變化而變化。在一定pH條件下,氨基酸分子中所帶正電荷數和負電荷數相同,即凈電荷為0。此時溶液的pH即該氨基酸的等電點pI。

茚三酮反應:氨基酸與茚三酮發生反應生成紫色化合物,(脯氨酸生成黃色化合物)在570nm處有最大光吸收。

定量分析——分光光度法,定性分析——薄層層析分離,鑒定。

Sanger反應:(測氨基末端的氨基酸種類)氨基酸與2,4-二硝基氟苯(DNFB)反應生成黃色化合物。

Edman反應:測定蛋白質氨基酸序列,氨基酸與苯異硫氰酸酯(PITC)反應。

氨基酸混合物的分離分析:

①層析:樣品各組分理化性質不同,表現出對固定相和流動相的親和力不同,當混合物通過多孔的支持物,它們受固定相和流動相的推力不同。紙層析、分配柱層析、薄層層析。離子交換層析:離子交換樹脂對各離子不同的親和力。其中,固定相是離子交換樹脂,流動相是具有一定pH和一定離子強度的電解質溶液。

②氣相色譜:層析系統的流動相為氣體,固定相為塗在固體顆粒表面的液體時,該層析技術稱為氣-液色譜簡稱氣相色譜。

③高效液相色譜法:以液體為流動相的快速,靈敏,高效的色譜分離技術。

2.蛋白質的分子結構特點及其與功能的關係

蛋白質的結構:

①蛋白質一級結構是指多肽鏈中氨基酸的排列順序及二硫鍵的位置。

②蛋白質二級結構是指多肽鏈主鏈本身的摺疊或盤繞方式,其穩定性主要由主鏈上的氫鍵決定。二級結構主要包括α-螺旋,β-摺疊,β-轉角和無規捲曲。

③蛋白質三級結構是多肽鏈在二級結構的基礎上進一步盤繞摺疊形成的完整的空間結構。三級結構包括肽鏈上所有原子的空間排布,超二級結構和結構域是三級結構的結構部件,穩定蛋白質三級結構的作用力包括氫鍵、離子鍵、疏水鍵、范德瓦耳斯力和二硫鍵。

④蛋白質四級結構是指具有獨立三級結構的多肽鏈,彼此締合而形成的聚合體結構,穩定四級結構的作用力主要是次級鍵。在具有四級結構的蛋白質中,每一個具有獨立三級結構的多肽鏈稱為該蛋白質的亞單位或亞基。

蛋白質結構與功能的關係:

蛋白質一級結構與功能的關係:蛋白質的一級結構決定其高級結構並最終決定了蛋白質的功能,不同物種的同源蛋白質一級結構相似,空間結構及功能也相似,而不同物種的同源蛋白質一級結構的差異程度取決於物種之間在進化上的親緣關係。由於基因突變,導致蛋白質一級結構發生變異,可使該蛋白質生物學功能部分或全部喪失,甚至導致疾病發生。

蛋白質空間結構與功能的關係:蛋白質的生物學功能直接由其特定的空間結構所決定,一旦空間結構被破壞功能也就喪失。蛋白質在執行功能時一般需要構象的變化,這種構象的變化可能是劇烈的(別結構蛋白)也可能是細微的。

3.蛋白質一級結構的測定方法:

蛋白質一級結構的測定就是確定蛋白質或多肽鏈中氨基酸的排列順序。

蛋白質一級結構的測定主要包括以下基本步驟:

①測定蛋白質分子中多肽鏈的數目:一般根據蛋白質,N端或C端殘基的量和蛋白質的相對分子質量來確定。

②拆分蛋白質分子的多肽鏈:如果多肽鏈接是通過非共價鍵締合的,可以用8mol尿素處理,如果多肽鏈之間是通過共價二硫鍵交聯的,則需要採用過甲酸將二硫鍵氧化,或用過量的β-巰基乙醇處理,將二硫鍵還原。

③分析每一條多肽鏈的氨基酸組成:將待測樣品進行完全水解,用氨基酸分析儀測定其氨基酸組成。

④鑒定多肽鏈的氮端或碳端殘基,常用的方法有:N-末端分析:二硝基氟苯(DNFB)法、丹磺酰氯(DNS)法、異硫氰酸苯酯法。C-端:肼解法。

⑤將多肽鏈裂解成較小的片段,斷裂多肽鏈的方法有化學法和酶解法。

⑥分離純化小的肽段,並測定各肽段的氨基酸序列。一般採用電泳或色譜方法分離純化小肽段。常用Edman降解法測定各肽段的氨基酸序列。

⑦重建完整多肽鏈的一級結構。

⑧確定二硫鍵的位置。確定二硫鍵位置的方法為對角線電泳。

4.蛋白質的重要理化性質及相對分子質量的測定

蛋白質的理化性質:

①蛋白質的紫外吸收性質:酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸殘基在近紫外區有光吸收,致使蛋白質在280納米有最大的光吸收。

②蛋白質的兩性性質及等電點:蛋白質溶液的pH影響其兩性解離,當溶液的pH為該蛋白質的pI時蛋白質分子凈電荷為零。蛋白質分子在電場中的移動方向和速度取決於所帶凈電荷的性質,數量以及分子顆粒的大小和形狀。

③蛋白質的膠體性質:由於蛋白質分子很大,蛋白質顆粒直徑為1~100納米,它在水中能夠形成膠體溶液,不能透過半透膜,因此可以用透析法將蛋白質溶液中的非蛋白質小分子雜質除去。

④蛋白質的沉澱:在蛋白質溶液中加入適當試劑,破壞蛋白質的水化膜或中和蛋白質分子表面的電荷,致使蛋白質膠體溶液變得不穩定而發生沉澱,蛋白質沉澱的方法包括鹽析、有機溶劑沉澱、等電點沉澱、加熱變性沉澱、重金屬鹽沉澱、生物鹼試劑和某些酸類沉澱。

⑤蛋白質的變性及復性:天然蛋白質應受物理化學因素的影響,分子中的次級鍵被破壞,天然構象解體而導致變性,蛋白質變性後生物活性喪失更容易被水解,溶解度降低、黏度增大、結晶行為發生變化,除去變性因素,在適當條件下,某些變性的蛋白質可恢復其天然構象與生物活性,此即蛋白質的復性。

蛋白質相對分子質量的測定:

凝膠過濾層析法:過濾、洗脫,大分子先洗脫下來。

SDS-PA GE聚丙烯酰胺凝膠電泳:電泳測定不同蛋白質遷移率和標準蛋白質比較。(SDS:十二烷基硫酸鈉,破壞蛋白質的beta巰基乙醇、二硫鍵)元素分析法。

沉降速度法:在離心場中,蛋白質分子所受到的凈離心力與溶劑的摩擦力平衡時,每單位離心場的沉降速度稱為沉降係數。

5.蛋白質的分離純化及含量的測定:

蛋白質分離純化的一般程序包括以下幾個步驟:

①材料的預處理及細胞破碎:機械法,滲透壓衝擊法,反覆凍融法,超聲波法,酶法。

②蛋白質的抽提:通常選擇適當的稀鹽緩衝液提取蛋白質。

③蛋白質的粗分離:根據蛋白質溶解度的差異進行分離常用的方法,有鹽析沉澱法、有機溶劑沉澱法、等電點沉澱法。

④蛋白質的細分離:

根據分子大小可用透析、超濾密度梯度離心、凝膠過濾。根據溶解度不同,可用等電點沉澱、鹽析、有機溶劑沉澱。

根據所帶電荷不同,可用電泳、離子交換層析。

根據其吸附性質,可用吸附層析。

根據對配體分子的親和力不同,可用親和層析。

蛋白質含量的測定:

①凱氏定氮法:蛋白質分子平均含氮量為16%,通過測定樣品中氮元素的含量即可計算出蛋白質含量。

②紫外吸收法,測定蛋白質溶液在280nm的吸光度吸光度與蛋白質含量成正比。

③雙縮脲法,蛋白質中兩個以上相鄰的肽鍵,在鹼性溶液中能與硫酸銅反應,產生紫紅色絡合物在540nm比色,吸光度與蛋白質含量成正比。

④福林-酚試劑法,首先是雙縮脲反應,反應生成紫紅色絡合物,絡合物中所含的酪氨酸、色氨酸殘基還原磷鉬酸和磷鎢酸試劑,即福林-酚試劑,得到深藍色產物,產物在500nm比色,吸光度與蛋白質含量成正比,靈敏度比雙縮脲法高。

⑤染料結合法考馬斯亮藍法:考馬斯亮藍G-250在遊離狀態下呈紅色,最大光吸收在488nm。它與蛋白質結合後變為青色複合物,複合物在595nm波長下有最大光吸收,吸光度與蛋白質含量成正比。